Institutos y Centros / INITRA

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CRONOGRAMA

Fecha: viernes 12 de julio
Disertante: Dra. Yael Filipiak
Facultad de Veterinaria. Universidad de la República (UDELAR). Departamento de Reproducción Animal, Área Biotecnología de la Reproducción
Tema: Estudio del semen sexado en la Fertilización in vitro en bovinos

La posibilidad de predecir el sexo especialmente en la producción bovina, representa un avance significativo para la producción. La identificación del sexo de los espermatozoides permite predeterminar el sexo en animales domésticos en varias especies y es un aporte con un futuro trascendental en la ganadería bovina. Es posible mediante el citómetro de flujo que clasifica los espermatozoides por la pequeña diferencia de ADN entre los espermatozoides X e Y (aproximadamente 4% en bovinos) y los separa con precisiones de aproximadamente 90%. La aplicación del semen sexado en combinación con otras biotecnologías reproductivas podría implementarse potenciando los beneficios de ambas. La Fertilización in vitro (FIV) constituye un modelo experimental, existen numerosos reportes que correlacionan la fertilidad in vitro medida en porcentaje de clivaje y/o desarrollo embrionario con la fertilidad in vivo del semen y está correlacionada con la tasa de no retorno. Por otro lado, la FIV puede constituir en sí misma una técnica de elección para producir embriones del sexo deseado. Nos propusimos estudiar el comportamiento del semen sexado en la FIV comparando semen sexado vs. no sexado de distintos toros y diferentes métodos de capacitación y concentración de espermatozoides en el cocultivo con los ovocitos.

Fecha: viernes 19 de julio
Disertante: Mg. Gabriela M. Teplitz
Becaria doctoral de CONICET. Cátedra de Histología y Embriología, INITRA (FVET-UBA)
Tema: Evaluación del desarrollo de embriones tempranos mediante el uso de una plataforma de transcriptómica y epigenética. Experiencia en FIV porcina en Universidad Laval, Canadá.

El estudio del desarrollo de embriones tempranos continúa siendo un desafío debido en mayor parte a una limitación en la cantidad de material. Es por esto que la amplificación del ácido nucleico hace que el estudio de la fisiología embrionaria sea más accesible. Las plataformas de microarray y, más recientemente ARNseq, hicieron posible que el transcriptoma del embrión temprano sea una técnica de rutina. Las plataformas de trancriptómica se han utilizado para estudiar la interacción del embrión temprano en diversas especies con su microambiente inmediato. Esta técnica es de mucha utilidad, pero no permite determinar si esas adaptaciones a las condiciones que rodean al embrión tendrán un impacto a largo plazo en el desarrollo. Es por esto, que para tener un panorama de la adaptación del embrión y de las posibles consecuencias a largo plazo, un estudio del epigenoma es necesario. La epigenómica y la transcriptómica están íntimamente relacionadas en términos de función génica y regulación y juntas modulan la expresión génica. El objetivo del trabajo realizado en la Universidad Laval fue evaluar el efecto del cocultivo con células luteales durante la maduración in vitro (MIV) en el desarrollo de los embriones producidos, evaluar el perfil de expresión génica por medio de un microarray de ARN de los embriones producidos con el sistema de cocultivo vs. embriones control y evaluar la metilación del ADN de los embriones producidos con el sistema de cocultivo vs. embriones control por medio de un microarray de ADN. El objetivo del seminario será contar la experiencia de trabajo en la institución y hablar sobre la metodología utilizada con las plataformas con las que cuentan y los resultados obtenidos.

Fecha: viernes 16 de agosto
Disertante: Dra. Carolina Luchetti
Investigadora asistente de CONICET. Cátedra de Histología y Embriología, INITRA (FVET-UBA)
Tema: Biotecnologías de la reproducción animal aplicadas al ganado bovino y porcino

Las biotecnologías de la reproducción animal son técnicas que favorecen la reproducción o permiten la introducción de una característica deseada. Abarcan desde la inseminación artificial hasta la edición génica de los cigotos a desarrollar. En el ganado bovino las mismas han progresado en gran medida en los últimos años. En el ganado porcino existe un gran potencial de aplicación, pero aún el desarrollo de dichas biotecnologías se encuentra un paso atrás respecto de los bovinos. Se repasarán las técnicas disponibles y su aplicación, realizando un recorrido por los últimos resultados de canción y edición génica.

Fecha: viernes 30 de agosto
Disertante: Dr. Mariano Buffone
Investigador Adjunto de CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental
Tema: Mecanismos regulatorios del calcio asociados a la capacidad fecundante de los espermatozoides

Sperm acquire the ability to fertilize in the female genital tract in a process called capacitation. During capacitation sperm undergo a change in the motility pattern called hyperactivation (HA) and acquire the ability to undergo acrosomal exocytosis (AR) which are critical to fertilization. Ca2+ is the primary second messenger that triggers HA motility and it depends on CatSper channels. It has been described that CatSper1 proteins form a unique pattern of four linear ‘‘stripes’’ running down the principal piece of the flagellum. Catsper Ca2+domains orchestrate the timing and extent of complex phosphorylation cascades because it colocalizes with Ca2+signaling molecules. On the other handAR is controlled by several players and one of them seems to be the actin cytoskeleton. Most studies to evaluate actin polymerization (formation of filamentous actin or F-actin) in sperm were performed using phalloidins, which are toxic and not capable of crossing the cell plasma membrane. We have used the powerful capabilities of super-resolution microscopy to reveal the location and regulation of signaling molecules in the sperm tail and for the first time, how are the dynamic changes in of the actin cytoskeleton at the onset of the AR.Our work also emphasizes the utility of live-cell nanoscopy for the study of sperm ultra-structures, where these imaging capabilities will undoubtedly impact the search for mechanisms that underlie basic sperm functions.

Fecha: viernes 13 de septiembre
Disertante: Dr. Alejandro Maruri
Cátedra de Histología y Embriología, INITRA (FVET-UBA)
Tema: Detección del antígeno de proliferación celular ki-67 como predictor del desarrollo in vitro de embriones bovinos

El desarrollo embrionario es consecuencia de procesos de proliferación y diferenciación celular que se reflejan en los cambios morfológicos y funcionales de los sucesivos estadios. Las metodologías tradicionales de evaluación de la cinética del desarrollo se basan en la observación embrionaria bajo lupa estereoscópica a tiempos definidos. Alteraciones en la proliferación celular pueden bloquear o reducir la velocidad de desarrollo y observarse una asincronía entre los diferentes estadios. La detección del antígeno de proliferación celular Ki-67 se utiliza ampliamente en histopatología tumoral por su valor pronóstico. La marcación del antígeno Ki-67 en embriones bovinos de estadios tempranos podría utilizarse como un parámetro de calidad embrionaria. El objetivo de este trabajo fue detectar la expresión del antígeno Ki-67 en embriones bovinos de día 2 y 7 de desarrollo, producidos en dos sistemas de cultivo con diferente rendimiento, con el fin de determinar su posible utilidad como predictor temprano del desarrollo in vitro. Para la producción de embriones, se obtuvieron complejos cumulus ovocitos a partir de ovarios de faena, se maduraron in vitro durante 22 h e incubaron con espermatozoides durante 5 h. Los presuntos embriones se cultivaron las primeras 48 h en dos sistemas diferentes: en cocultivo con células luteales bovinas (CLB-1) y en medio SOF sin células (control). Luego, en ambos casos se cultivaron en medio SOF hasta el día 8. El desarrollo embrionario se evaluó por observación bajo lupa estereoscópica los días 2 y 8. Se realizó inmunofluorescencia indirecta en embriones segmentados de día 2 y en blastocistos de día 7 de ambos grupos experimentales. Se determinó el índice de proliferación celular (IPC: células Ki-67+/ blastómeras totales) en cada uno de los embriones evaluados. Se utilizó la tinción con Hoechst 33342 para determinar el número total de blastómeras por embrión (NTC). Los embriones se observaron con un microscopio de fluorescencia. Los datos se analizaron estadísticamente considerando diferencias significativas con p < 0,05. No existieron diferencias significativas en el porcentaje de segmentación a día 2 (control: 84%, n = 141 vs. cocultivo: 83%, n = 133), sin embargo, el IPC fue significativamente mayor en el cocultivo (control: 0,13±0,023, n = 54 vs. cocultivo: 0,48±0,044, n = 65). Asimismo, el NTC no difirió entre los grupos (control: 8,3±0,58 vs. cocultivo: 8,2±0,55). El IPC en blastocistos de día 7 no mostró diferencias entre los grupos (control: 0,88±0,023, n = 17 vs. cocultivo 0,9±0,014, n = 15), así como tampoco el NTC (control: 76,7±5,33 vs. cocultivo: 83,5±6,77) a pesar de existir diferencias significativas en el rendimiento de blastocistos entre los grupos (control: 29,8%, n = 141 vs. cocultivo: 50,4%, n = 133). Se concluye que la detección del antígeno Ki-67 en embriones bovinos de estadios tempranos (día 2) podría utilizarse como predictor temprano de la competencia para el desarrollo in vitro. Por otro lado, la determinación del IPC en blastocistos no tendría el mismo valor, al menos en los sistemas de cultivo in vitro que fueron utilizados.

Fecha: viernes 27 de septiembre
Disertante: Dr. Mateo Anchordoquy
Investigador Asistente de CONICET. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata.
Tema: Importancia del zinc en la reproducción bovina

Hasta ahora las fallas reproductivas producto de la carencia de zinc (Zn) no han sido caracterizadas, no pudiéndolas asociar a un valor de zinquemia que alerte sobre el riesgo. El agregado de Zn al medio de maduración in vitro de ovocitos bovinos, en concentraciones similares a las concentraciones plasmáticas normales, mejora la calidad de los ovocitos madurados y en consecuencia, la capacidad de desarrollo embrionario posterior, aumentando la tasa y la calidad de los blastocistos. La destacada participación del Zn en el proceso madurativo del ovocito y en la competencia del mismo para sostener el desarrollo embrionario posterior hasta el estadio de blastocisto, nos conduce a expandir los estudios para evaluar el rol y los posibles mecanismos de acción del Zn y su suplementación tanto in vitro como in vivo.

Fecha: viernes 11 de octubre
Disertante: Dra. Carolina Bianchi
Profesor Adjunto Área de Endocrinología y Fisiología del Sistema Nervioso y Muscular. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Tandil.
Tema: Endocrinología de la luteólisis y reconocimiento materno de la preñez en llamas

Las llamas son animales de ovulación inducida requiriendo de la cópula en presencia de un folículo con un diámetro ≥ 7 mm, considerado ovulatorio en la especie. Luego de la ovulación, ocurre la formación del cuerpo lúteo y el inicio de la secreción de progesterona, necesaria para el mantenimiento de la preñez. Las concentraciones plasmáticas de progesterona comienzan a elevarse a partir del 4to día, alcanzan un pico máximo al día 8 y, en las llamas no preñadas, se detectan valores basales hacia los días 11 – 12 post inducción. La caída en las concentraciones plasmáticas de progesterona se correlaciona con una descarga pulsátil de prostaglandina F2α (PGF2α) y un aumento en la expresión endometrial de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), enzima limitante en la síntesis de prostaglandinas. Asimismo, se ha demostrado que la expresión de dicha enzima se incrementa cuando ocurre una desensibilización del endometrio a la progesterona, por la pérdida de sus propios receptores entre los días 8 y 10 post inducción de la ovulación. El cuerpo lúteo de las llamas tiene una vida media muy corta lo que condiciona que el reconocimiento materno de la preñez deba ocurrir en una etapa muy temprana del periodo gestacional, entre los días 8 a 12 post inducción de la ovulación. Estudios en la especie han demostrado que se produce una caída en los niveles plasmáticos de progesterona entre los días 8 y 18, coincidiendo con picos de PGF2α con una amplitud menor a los registrados en hembras no preñadas. En este sentido, se ha observado que en animales preñados ocurre una disminución en la expresión endometrial de COX-2, sugiriéndose que el embrión a través de la liberación de alguna sustancia (probablemente estrógenos) induciría una disminución en la expresión de dicha enzima y, de esta manera, inhibiría el proceso de luteólisis, permitiendo el rescate del cuerpo lúteo y el establecimiento de la preñez.

Fecha: viernes 18 de octubre
Disertante: Mg. Paula Gabriel
Cátedra de Física Biológica, INTRA (FVET – UBA)
Tema: Efecto de la vitrificación y cultivo in vitro post atemperado sobre folículos preantrales porcinos contenidos en láminas de corteza ovárica

La criopreservación de gametas es una de las biotecnologías de la reproducción más difundida. Una alternativa para la conservación de gametas femeninas es la vitrificación de láminas de tejido ovárico. Esta técnica permite preservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folículos preantrales (FPA). La elección de un soporte adecuado para realizar la vitrificación mejoraría su eficiencia. El cultivo in vitro post atemperado a tiempos cortos de láminas de tejido ovárico sería un método eficaz para evaluar los potenciales daños que pudieran ocasionar los agentes crioprotectores y el proceso de criopreservación sobre los folículos preantrales. La composición del medio de cultivo utilizado influiría en la eficiencia del proceso, permitiendo incrementar el porcentaje de folículos preantrales normales. El objetivo de este trabajo fue determinar un protocolo de vitrificación de folículos preantrales porcinos –primordiales y primarios- contenidos en láminas de corteza ovárica empleando diferentes soportes y evaluar el efecto del cultivo post-atemperado sobre la morfología y morfometría de dichos folículos. Se utilizaron ovarios porcinos provenientes de faena. Se estudió el efecto de diferentes soportes (Criotubos, Cápsulas BEEM® y agujas de acupuntura) sobre los FPA vitrificados/atemperados utilizando 30% Etilenglicol, 20% suero fetal bovino (SFB) y 0,25M sacarosa (n=10) como agentes crioprotectores. Se evaluó el efecto de distintos porcentajes de SFB en el medio de cultivo en presencia o ausencia de hormona folículo estimulante (FSH) sobre la morfología y morfometría de los FPA del tejido fresco (n=4). Para ello las láminas fueron cultivadas durante 24 hs a 39 °C, en cámara húmeda con 5% de CO2, en placas de cultivo p12. Se utilizó un medio de cultivo base: D-MEM, ITS (1mg/ml insulina, 0,55 mg/ml transferrina, 0,5 μg/ml selenio), 2 mM glutamina, gentamicina 10 µg/ml y anfotericina B 10 µg/ml, combinado con concentraciones crecientes de SFB (0%, 5%, 10% y 20%), en ausencia o presencia (50 ng/ml) de FSH pituitaria porcina. Finalmente, para determinar el efecto del cultivo in vitro sobre las láminas vitrificadas/ atemperadas utilizando el soporte de elección determinado previamente, las mismas fueron cultivadas durante 24 hs en el medio base suplementado con 10% SFB y con distintas concentraciones de FSH (0, 50 ng/ml y 100 ng/ml) (n=10). La evaluación morfológica se realizó sobre cortes histológicos teñidos con Hematoxilina-Eosina, con microscopía de campo claro (x400). El análisis morfométrico se realizó sobre fotos digitales de los FPA obtenidas con la cámara LEICA DCC-380X® con el soporte digital del programa de captura LAS LEICA Inc®. Se determinó el área nuclear (AN), citoplasmática (AC) y total (AT) de cada ovocito utilizando el software Leica Qwin Plus® versión 3.1. La relación área nuclear/ área citoplasmática (AN/AC) también fue calculada. Para analizar diferencias entre los tratamientos se realizó el test no paramétrico de varianza por rangos de Friedman (p< 0,05). La vitrificación de tejido ovárico disminuyó el porcentaje de folículos morfológicamente normales y redujo los parámetros morfométricos evaluados en comparación con el tejido fresco. De los tres soportes evaluados, las cápsulas BEEM® produjeron la mayor reducción de folículos morfológicamente normales, mientras que no se observaron diferencias significativas en el uso de criotubos o agujas de acupuntura. A su vez, las cápsulas produjeron una reducción significativa del AN de los ovocitos de los FPA primordiales en comparación con los otros dos soportes. En los folículos primarios, los ovocitos preservaron mejor la relación AN/AC al utilizar agujas de acupuntura. El cultivo in vitro de láminas de tejido ovárico fresco en un medio con bajos porcentajes de SFB (0% y 5%) en ausencia de FSH produjo una reducción significativa en el porcentaje de FPA normales con respecto al control y los restantes tratamientos. En el caso de los FPA primordiales produjo además una reducción significativa del AN y la relación AN/AC. Con el agregado de 50 ng/ml de FSH se observó una reducción significativa del porcentaje de FPA morfológicamente normales al combinarla con 20% de SFB en comparación con el control y los demás tratamientos. El cultivo in vitro post atemperado de las láminas en un medio sin FSH redujo de manera significativa el porcentaje de FPA normales con respecto a los restantes tratamientos. También provocó una mayor reducción en los valores de AN en comparación con los medios suplementados con FSH. El uso de 100 ng/ml de FSH permitió preservar el mayor porcentaje de FPA primordiales normales en comparación con los otros dos medios. En base a los resultados obtenidos, para nuestro sistema de vitrificación de láminas de corteza ovárica porcina con etilenglicol 30% y 0,25 M sacarosa, los soportes más adecuados serían los criotubos y las agujas de acupuntura. Dada la facilidad en el manejo de las agujas de acupuntura, su uso sería recomendado. Para el cultivo in vitro post atemperado a tiempos cortos de láminas de tejido ovárico porcino se sugeriría la suplementación del medio de cultivo con 10% SFB y 100 ng/ml de FSH.

Fecha: viernes 8 de noviembre
Disertante: Dr. Andrés Gambini
Investigador Asistente CONICET. Cátedra de Fisiología Animal (FAUBA - UBA)
Tema: A confirmar

Fecha: viernes 22 de noviembre
Disertante: Dra. Fernanda Fumuso
Becaria Posdoctoral CONICET. Cátedra de Teriogenología, INITRA (FVET - UBA)
Tema: El plasma seminal y sus implicancias en la fisiología reproductiva y espermática en camélidos sudamericanos

El plasma seminal (PS) en los Camélidos Sudamericanos posee múltiples roles sobre la fisiología reproductiva de estas especies y, continúan descubriéndose cada vez más posibles implicancias del mismo a nivel espermático. El PS no sólo presenta singularidades estructurales como la filancia y viscosidad estructural elevada, sino que también posee particularidades a nivel bioquímico. Se determinó que la proteína SL15 perteneciente a la familia de las lecitinas se encuentra en el PS de la llama y, podría ser la responsable de la formación del reservorio espermático al unirse a la N-acetilgalactosamina presente en el epitelio oviductal. Por otro lado, aproximadamente la mitad del componente proteico del PS en los camélidos está conformado por el factor de crecimiento nervioso beta (β-NGF) el cual no sólo estaría involucrado en el proceso de ovulación de las hembras de camélidos sino que también, podría jugar un rol a nivel espermático. La presencia de receptores de dicho factor (TrKA) en la pieza intermedia espermática, sitio de localización de las mitocondrias, junto con la estrecha relación determinada entre el PS y el patrón de movilidad espermático, podría sugerir la participación del β-NGF en la movilidad oscilatoria característica del espermatozoide de eyaculado de llama. Por otro lado, se he investigado el rol del PS en la criopreservación de dicho gameto, determinándose que no habría un efecto protector en la conservación de espermatozoides de llama, cuando el PS es adicionado tanto en forma previa o posterior a la criopreservación.

Director: Dr. Daniel M. Lombardo
Coordinadoras: Mg. Teplitz Gabriela y Dra. Fumuso Fernanda