REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Biomarcadores moleculares en mastitis bovina

Caggiano, N1; De Simone, E1.

1 Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Fisiología Animal

Recibido:15/07/2021
Aceptado:14/02/2022

Correspondencia e-mail:Emilio De Simone edesimone@fvet.uba.ar

Resumen

La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria, generalmente derivada de una infección microbiana. Es la patología con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando la producción láctea y la rentabilidad de los tambos. Además, si el proceso es muy grave o perdura en el tiempo genera daños muchas veces irreversibles en la glándula mamaria. Es por eso que, además del recuento de células somáticas, y el análisis del perfil proteico, la evaluación de marcadores moleculares relacionados con la inflamación resulta de interés para el diagnóstico temprano, control y pronóstico de la enfermedad. Marcadores moleculares como las metaloproteasas (MMPs), lactato deshidrogenasa (LDH), N-Acetil-β-D-Glucosaminidasa (NAGasa), Beta glucuronidasa y los glicosaminoglicanos (GAGs) también se encuentran relacionados con la enfermedad mamaria. Algunos biomarcadores involucran proteasas que degradan la matriz extracelular como pueden ser las metaloproteasas 2 y 9 entre otras. Estas proteasas fisiológicamente están encargadas del normal remodelado de la matriz extracelular. Sin embargo, las proteasas juegan un rol preponderante en la fisiopatología de los procesos mastíticos, especialmente en su presentación recidivante, siendo la inhibición de las MMPs una propuesta terapéutica interesante. Las enzimas LDH, NAGasa y beta glucuronidasa son indicadores de inflamación dado que el incremento de su actividad se asocia con gránulos de lisosomales de leucocitos. Los GAGs son constituyentes de la matriz extracelular y podrían utilizarse como indicadores de sanidad mamaria, porque se mantienen constantes en leche a lo largo del proceso productivo de los animales sanos y se elevan ante procesos patológicos leves. El análisis y seguimiento de marcadores en vacas lecheras podrían ser un complemento importante de las pruebas convencionales para el diagnóstico y seguimiento de la sanidad de la glándula mamaria.

Palabras clave:mastitis, biomarcadores, diagnóstico, MMPs, GAGs

Molecular biomarkers in bovine mastitis

Summary

Mastitis is an inflammation of the mammary gland generally caused by a bacterial infection. It is the disease that has the highest morbidity and mortality within dairy herds, affecting milk production and the profitability of the dairy farms. Besides, if the process is severe or prolonged, it often causes irreversible damage to the mammary gland. In addition to the somatic cell count and profile protein analysis, the evaluation of molecular markers related to inflammation is of interest for the early diagnosis, control and prognosis of the disease. Molecular markers such as metalloproteinases (MMPs), lactate dehydrogenase (LDH), N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGase), Beta glucuronidase, and glycosaminoglycans (GAGs) are also related to udder disease. Some biomarkers involve proteases that degrade the extracellular matrix, such as metalloproteinases 2 and 9, among others. These proteases are physiologically responsible for the normal remodeling of the extracellular matrix. However, proteases play a preponderant role in the pathophysiology of mastitic processes, especially in their recurrent presentation, with the inhibition of MMPs being an interesting therapeutic proposal. The enzymes LDH, NAGase and beta glucuronidase are indicators of inflammation, since the increase in their activity is associated with leukocyte lysosomal granules. GAGs are constituents of the extracellular matrix and could be used as indicators of mammary health, because they remain constant in milk throughout the productive process of healthy animals and rise in light of mild pathological processes. The analysis and monitoring of markers in dairy cattle could be an important complement to conventional tests for the diagnosis and monitoring of the health of the mammary gland.

Key words:mastitis, biomarkers, diagnosis, MMPs, GAGs

INTRODUCCIÓN

La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria, generalmente derivada inicialmente de una infección microbiana. Es la enfermedad con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la producción láctea24.
Las mastitis pueden ser clasificadas de diversas maneras y su clasificación nos facilita el diagnóstico y tratamiento. Según el punto de vista clínico las mismas pueden clasificarse en: a. clínicas, que son fácilmente diagnosticables a través de la revisación de la glándula mamaria y de las modificaciones macroscópicas de la secreción láctea y b. subclínicas que sólo pueden ser determinadas a través del Conteo de Células Somáticas (CCS). En el primer caso, las mastitis clínicas se pueden clasificar en distintos grados según la intensidad en que se presenta la enfermedad: grado 1 cuando se ve afectada solo la secreción láctea, grado 2 si se ve afectada la secreción láctea y la glándula mamaria y grado 3 cuando se ve afectada la secreción láctea, la glándula mamaria y además hay signos sistémicos54.
En Estados Unidos, país con altos estándares productivos, 99.7 % de los establecimientos, reportaron al menos un caso de mastitis. Asimismo 24,8 % de las vacas presentaron mastitis clínica68. En Países Bajos el porcentaje de vacas que padecen mastitis clínicas es similar siendo del 28,1 %39. En Argentina, distintos trabajos indicaron una prevalencia mucho menor de mastitis clínicas en tambos de la provincia de Córdoba de 2.5 %61 y 6,7 %69. Mientras que la incidencia de mastitis subclínica informada en tambos de nuestro país fue de 53.9%17. Autores de distintos lugares del mundo reportaron incidencias de mastitis subclínicas entre un 20 a 50 % en rodeos lecheros de explotaciones intensivas y extensivas 1,58,6.
Los principales agentes etiológicos responsables, tanto de las mastitis clínicas como de las subclínicas, son los géneros Staphylococcus y Streptococcus, tomando mayor relevancia a nivel mundial Staphylococcusz aureus (S. aureus)62. La prevalencia de organismos patógenos descripta por Neder y colaboradores en tambos de Argentina fue: S. aureus (42.60 %), Streptococcus uberis(Str. uberis) (27.10 %), Streptococcus dysgalactiae (Str. dysgalactiae) (10.90 %) y Streptococcus agalactiae (Str. agalactiae) (4,70 %)50.
Las consecuencias económicas sobre el manejo del rodeo de esta enfermedad son muy importantes ya que la misma disminuye la producción láctea de los animales afectados, reduce la ingesta alimentaria, aumenta la cantidad de leche que se descarta por mala calidad, incrementa los costos veterinarios y genera el rechazo prematuro de animales del tambo67. Otra serie de estudios también asocian la mastitis con una disminución en la pérdida de eficiencia reproductiva en general65. Por otra parte, la mastitis provoca la merma de la calidad de los productos derivados de la leche siendo su prevención, diagnóstico y tratamiento un gran desafío para el profesional veterinario, especialmente en aquellos casos en que la enfermedad recidiva en forma insistente. Además, el uso repetitivo de antibióticos en la producción de bovinos debido a esta enfermedad contribuye al desarrollo de resistencia en especies microbianas causantes de mastitis42.
Esta situación conlleva a grandes pérdidas económicas ya que el costo de tener un animal con mastitis subclínica se eleva en un 70 %, no solo debido a su menor producción láctea sino también por el daño asociado del tejido glandular, que en algunos casos es irreversible, aún después del tratamiento, y lleva al descarte temprano del animal53. Anualmente a nivel mundial se pierden más de 500.000 millones de dólares a causa de las mastitis subclínicas 55,18. El diagnóstico de las mastitis subclínicas es variado e incluye métodos al pie de la vaca como el Test Mastitis California (TMC) y de conductividad eléctrica o métodos como el conteo de células somáticas (CCS) a través de contadores de células automáticos64,33,3.
A continuación, describiremos el método más utilizado a campo que es TMC que se fundamenta en la detección del incremento de las células somáticas y posteriormente desarrollaremos biomarcadores utilizados y en desarrollo para el diagnóstico de mastitis.

Test de Mastitis California y Conteo de Células Somáticas

Como se mencionó anteriormente las células somáticas en la leche disminuyen la calidad de esta. El conteo de células somáticas es un método indirecto de diagnóstico para las mastitis subclínicas, dado que el aumento de células somáticas se correlaciona directamente con la inflamación de la glándula mamaria.
Una forma práctica y rápida de estimar de forma semicuantitativa las células somáticas es mediante el Test de Mastitis California. Esta prueba consiste en disrumpir las membranas celulares permitiendo que el ADN de las células interactúe con el reactivo produciendo una gelificación que puede ser visualizada macroscópicamente.
EL CCS ya sea analizado de forma indirecta mediante el TMC o directa mediante citometría es una importante herramienta para el monitoreo de la sanidad de la glándula mamaria10. Se considera que las vacas presentan mastitis subclínica cuando el recuento de las células somáticas en leche es mayor de 1 o 2 × 105  células/ml38. Fisiológicamente, los leucocitos polimorfonucleares aumentan tras el destete y en la involución temprana, sin embargo, más tardíamente las células que aumentan son los macrófagos.
Una correcta rutina de ordeñe, junto con pautas de control y monitoreo de los niveles de células somáticas, son cruciales para mantener la salubridad mamaria. Existen algunos estudios que plantean la administración de melatonina exógena por vía subcutánea para reducir el recuento de células somáticas en la leche, mejorando la actividad inmune de las vacas e incrementando sus niveles de IgG e IgM.71.

Perfil de proteínas

El perfil de proteínas en leche puede ser analizado mediante SDS-PAGE (Figura 1). Durante el transcurso de los procesos de mastitis la integridad de la barrera hemato-láctea se ve afectada permitiendo el pasaje de proteínas séricas hacia la leche. Estas proteínas en los análisis electroforéticos se las refiere como proteínas de alto peso molecular para diferenciar de las proteínas lácteas como la caseína (fracciones alfa, beta y kappa), lactoalbúmina y lactoglobulina que poseen menos de 30kDa. La presencia de componentes séricos en la secreción láctea, así como la disminución de la caseína, está asociada a una menor calidad de la leche. En trabajos previos hemos observado que la proteína total en los procesos mastíticos no se ve significativamente afectada, sin embargo mediante el análisis densitométrico por SDS-PAGE hemos ob-servado un aumento considerable de las proteínas de alto peso molecular y una caída importante de caseína principalmente la fracción kappa caseína, una de las más valoradas en la industria quesera9. Las proteínas que se encuentran clasificadas como de alto peso molecular incluyen a la lactoferrina, lactoperoxidasa, inmunoglobulina y albúmina sérica. Estas proteínas se encontrarían incrementadas en la leche debido al aumento de la permeabilidad vascular como consecuencia de los procesos inflamatorios49,63. En animales con mastitis la kappa caseína se encuentra disminuida principalmente debido a la acción de proteasas que se encuentran incrementada en estos tipos de procesos25.
S. aureus es un patógeno que secreta proteasas capaces de degradar las caseínas. Además, en bovinos, los cuartos afectados por S. aureus tienen un área alveolar más pequeña y un área estromal más grande en comparación con los cuartos sanos. Siendo que la sección infectada tiene una capacidad de síntesis reducida. Esta observación podría aplicarse a otras especies de rumiantes productores de leche45.
Asimismo, durante los procesos inflamatorios, las enzimas implicadas en el proceso de síntesis de proteínas de la leche tienen una actividad menor59.
Por otro lado, se ha visto que la cantidad de kappa caseína puede variar de un animal a otro. Esto responde a variaciones genéticas como han descripto Medrano y Aguilar-Córdova en vacas Holstein donde el alelo B de la kappa caseína está relacionado a un mayor rendimiento y calidad de esta proteína47.

Metaloproteasas (MMPs)

Las metaloproteasas de matriz 2 y 9 (MMP-2 y MMP-9 respectivamente) son endopeptidasas dependientes de zinc que desempeñan un papel crucial en la degradación de la matriz extracelular, la inflamación y la remodelación tisular. Participando en procesos fisiológicos y patológicos. En los últimos años se ha visto que estas proteasas juegan un rol muy importante en la progresión de procesos tumorales y su actividad puede ser inhibida por quelantes de zinc57,70. Todos los genes de las MMPs presentan una estructura modular altamente conservada5 . Entre algunos procesos fisiológicos en los que participan las MMPs están el desarrollo embrionario, los procesos de remodelación y envejecimiento19. La principal fuente de MMPs son los leucocitos circulantes. Es por ello que las MMPs cumplen un rol central en el proceso de daño tisular como consecuencia de las mastitis.
Trabajos previos indican que las células somáticas en la leche secretada por vacas que sufren de mastitis presentan una alta actividad de MMPs7,9,2. Li y colaboradores mostraron una correlación positiva entre el recuento de células somáticas en leche y la MMP-9, siendo además que la infección por S. aureus incrementaba de manera notoria la expresión de MMP-9 por las células epiteliales de los ductos mamarios43. También, el incremento de la expresión de MMP-9 es un importante marcador de la infección mamaria por E. coli44. A su vez, se ha demostrado que las MMPs 2 y 9 degradan la membrana basal y las proteínas.




Figura 1.Perfil de proteínas de la leche analizado mediante SDS-PAGE 15%. En la calle 1 se observa la muestra control de leche bovina donde se indican las proteínas presentes: α-caseína (α-CN), β- caseína (β-CN), κ- caseína (κ-CN), β-lactoglobulina (β-Lg) y α-lactoalbúmina (β-Lg). Calles 2-8 diferentes muestras de leche bovina.



intersticiales, y se encuentran incrementadas hasta 300 veces en la leche de vaca con mastitis colibacilar en comparación con la leche de animales sanos45. Igualmente, se observó incrementos de la actividad de la MMP-2 y MMP-9 en tejido mamario y secreciones en cuartos mamarios de vacas infectadas crónicamente con S. aureus, en comparación con sus cuartos sanos4 . Además, se observó que los fibroblastos tratados con S. aureusz inactivado mostraron un incremento en la actividad de la MMP-248.
La activación de MMPs perdura incluso después de resuelto el proceso infeccioso-inflamatorio. Estas metaloproteasas y el daño tisular que producen podrían ser la causa incluso de mastitis en las cuales el TMC da positivo, aunque los cultivos den negativos. La posibilidad de generar y probar sustancias inhibidoras de las MMPs en coincidencia con las mastitis no solo podrían favorecer la resolución de mastitis, sino que también podrían reducir el uso de antibióticos favoreciendo un uso más prudente de los mismos lo que disminuiría la resistencia a los mismos. Sin embargo, Gifre-Renom y colaboradores indicaron que la infusión en la glándula mamaria de cuerpos de inclusión de MMP-9 como nanopartículas al momento del secado favorecería la involución y la función inmune de la glándula mamaria como consecuencia de la acción fisiológica de esta proteasa durante el secado23.
Las MMPs 2 y 9 presentan en su forma activa un peso molecular de 72 y 92 kDa respectivamente. Una forma de analizar la actividad de las MMPs es mediante Zimografía en SDS-PAGE con el agregado de gelatina (Figura 2).
La activación de MMPs se puede dar por múltiples mecanismos entre los que están involucrados el potencial redox intracelular y la presencia de diversas citoquinas20. Además, la actividad de las MMPs está regulada por los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMPs) presentes en los tejidos11. Los TIMPs regularían amortiguando la actividad de las MMPs.




Figura 2.Análisis de la actividad de las MMPs mediante Zimografía en SDS-PAGE 10% con el agregado de 0.2% de gelatina. De izquierda a derecha calle 1 control MMP-9, calle 2 control MMP-2 y calles 2-8 corresponde a diferentes muestras de leche bovina.



N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGasa)

Esta enzima se encuentra presente en los gránulos lisosomales de los leucocitos polimorfonucleares pudiendo también ser liberada además cuando hay daño de las células epiteliales de la glándula mamaria, por lo que su incremento acompaña los procesos inflamatorios de la glándula mamaria59. La NGAasa está asociada con lisis celular y daño tisular29. Además, presenta un efecto bactericida favoreciendo la reducción bacteriana30.
La NAGasa es un importante biomarcador de mastitis bovina y se correlaciona muy bien con el recuento de células somáticas60. La técnica de determinación de la actividad de esta enzima fue descripta por primera vez por Kitchen y colaboradores en 198437.

Lactato Deshidrogenasa (LDH)

La LDH es una enzima ubicua que está presente en el citoplasma de todas las células ytejidos del organismo. Esta enzima puede considerarse un indicador confiable de la intensidad del proceso inflamatorio en la glándula mamaria, especialmente en el caso de mastitis subclínica. Este biomarcador puede resultar muy útil para los sistemas automatizados de control de mastitis. Por este motivo la cuantificación de LDH puede monitorear la sanidad de glándula mamaria ya que sus valores se incrementan durante procesos infecciosos28. Asimismo, la presencia de LDH en leche también estaría indicando una disrupción de la barrera hemato-lechera producida por la mastitis41. Se notificó que las infecciones por ciertas bacterias produjeron mayores incrementos, siendo que E. coli y Str. uberis mostraron los mayores incrementos27. Otro autor describió mayores incrementos en infecciones por bacterias Gram negativas36. Además, la LDH muestra una mayor sensibilidad que la NAGasa para identificar mastitis subclínicas12.

Beta glucuronidasa (β-glucuronidasa)

La β-glucuronidasa es otra enzima lisosomal que también es un marcador relevante que se incrementa en procesos inflamatorios de la glándula mamaria52. Sin embargo, la poca actividad de la misma le quitaría importancia respecto a otros biomarcadores40.

Glicosaminoglicanos (GAGs)

Los GAGs son moléculas que se encuentran principalmente en el tejido conectivo de diversos tejidos, entre ellos la glándula mamaria. Es por ello que los GAGs pueden llegar a ser una alternativa interesante para evaluar in situ la sanidad de los animales en producción.
Los GAGs son cadenas de polisacáridos largas no ramificadas22. La presencia de grupos carboxilos y sulfatos le dan a los GAGs la propiedad de ser muy hidrofílicos. Esta propiedad hace que puedan estar en forma de gel y ocupar grandes espacios de la matriz extracelular dando sostén a distintos tejidos32. La mayoría de los GAGs se encuentran covalentemente unidos a proteínas formando proteoglicanos26. Dentro de los GAGs, el más importante en la glándula mamaria es el ácido hialurónico, este GAG cumple funciones en la embriogénesis, morfogénesis, reparación tisular e inflamación de este órgano35. Otro GAG de importancia en la glándula mamaria es el versican, éste es un modulador del comportamiento celular, el cual en relación a distintos factores de crecimiento puede controlar la acción de células madre en el tejido mamario46. Más allá de estar presentes en los tejidos previamente citados, se pueden encontrar GAGs en la leche donde principalmente cumplen funciones en relación con la inmunidad de la glándula mamaria51.
Cuando comparamos los niveles de GAGs en leche de animales sanos, con mastitis subclínica y con mastitis clínica pudimos observar que los animales sanos son los que menos niveles de GAGs contienen, mientras que los animales afectados subclínicamente tienen un nivel intermedio y los animales con signología clínica tienen los mayores niveles8 . Si bien entre los distintos grados de mastitis no se encontraron diferencias significativas, si hubo diferencias con respecto a los individuos sanos. Esto puede ser explicado en parte debido a que proteasas como las metaloproteasas 2 y 9 se ven aumentadas durante las mastitis9 . Por lo tanto la degradación de la matriz extracelular permitiría la liberación hacia la secreción láctea de los GAGs presentes en la misma.
El aumento de los GAGs ante procesos infecciosos fue descripto en varias enfermedades. Por ejemplo, se ven aumentados los niveles de ciertos GAGs, como el ácido hialurónico o el versican, ante afecciones respiratorias inducidas por E. coli en ratones13. Por otro lado, bacterias como S. aureus y Streptococcus pneumoniae pueden degradar GAGs de sus cores proteicos, tanto por proteasas propias como del hospedador, dejándolos libres aumentando su concentración en los fluidos corporales14,56. Además, algunas bacterias de los géneros Streptococcus, Escherichia y Pasteurella pueden sintetizar GAGs similares a los encontrados en mamíferos como parte constitutiva de su cápsula16,15. Esto hace razonable que ante procesos infecciosos en la glándula mamaria los GAGs se vean aumentados. Pero más allá de verse aumentados en este tipo de proceso, también se ven aumentadas estas moléculas en tejidos que están bajo un proceso inflamatorio31. Con lo cual el aumento de los GAGs en animales con cultivos bacteriológicos negativos podría ser explicado por lo previamente dicho o porque el agente etiológico infeccioso no fue diagnosticado.
Con respecto a los resultados observados en relación al TMC y los GAGs, resulta interesante que éstos últimos se vean aumentados en los animales con mastitis subclínica de grado I, ya que es el grado donde se observa menor especificidad del TMC, siendo que ya de por sí la sensibilidad de la técnica es deficiente34,21.
Esto hace que la determinación de los GAGs podría sumarse como una herramienta para la toma de decisiones en los establecimientos ya que podríamos tener una prognosis sobre la performance productiva de un animal, similar al uso que se le da en medicina humana en relación a distintas neoplasias66. Por lo tanto, este tipo de moléculas, evaluadas en su totalidad, serían indicadores del estado de sanidad, ya que ante leves variaciones nos indican la presencia de procesos mastitícos8 .

CONCLUSIONES

A lo largo de este trabajo hablamos del impacto económico de la mastitis bovina en los rodeos lecheros y la importancia de su rápido diagnóstico para disminuir dicho impacto. Para ello necesitamos de técnicas que sean fiables y fáciles de implementar en condiciones a campo. Es por ello que requerimos la optimización de las pruebas con las que ya contamos, como el TMC o el CCS, tanto como la adaptación de pruebas que se desarrollan a nivel laboratorio como la determinación de MMPs, perfiles proteicos o GAGs. Un ejemplo de ello es lo que sucede con la LDH que está siendo incorporada en sistemas robotizados y que se combina con otras determinaciones como el CCS en línea. Esto nos da la pauta de que los sistemas de diagnósticos del futuro tendrán un abanico de técnicas que permitirán una rápida y segura detección de animales con procesos inflamatorios incipientes.

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