Seminarios de Actualización del Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA) 2019
Director: Dr. Daniel LOMBARDO.
Coordinadoras: Mg. Teplitz, Gabriela y Dra. Fumuso, Fernanda
Descripción: El objetivo es establecer un ámbito de intercambio de ideas para favorecer la aplicación de las investigaciones en curso a la resolución de problemas suscitados en la práctica.
Destinatarios: Veterinarios, Biólogos y Agrónomos.
Horario: 13:30 a 15:30 hs.
Aula 17 (Pabellón de Producción Animal)
Fecha: 18 de octubre de 2019.
Disertante: Mg. Paula Gabriel
Cátedra de Física Biológica, INTRA (FVET – UBA)
Tema: Efecto de la vitrificación y cultivo in vitro post atemperado sobre folículos preantrales porcinos contenidos en láminas de corteza ovárica.
Carga horaria: 2 horas
Resumen:
La criopreservación de gametas es una de las biotecnologías de la reproducción más difundida. Una alternativa para la conservación de gametas femeninas es la vitrificación de láminas de tejido ovárico. Esta técnica permite preservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folículos preantrales (FPA). La elección de un soporte adecuado
para realizar la vitrificación mejoraría su eficiencia. El cultivo in vitro post atemperado a tiempos cortos de láminas de tejido ovárico sería un método eficaz para evaluar los potenciales daños que pudieran ocasionar los agentes crioprotectores y el proceso de criopreservación sobre los folículos preantrales. La composición del medio de cultivo utilizado influiría en la eficiencia del proceso, permitiendo incrementar el porcentaje de folículos preantrales normales. El objetivo de este trabajo fue determinar un protocolo de vitrificación de folículos preantrales porcinos –primordiales y primarios- contenidos en láminas de corteza ovárica empleando diferentes soportes y evaluar el efecto del cultivo post-atemperado sobre la morfología y morfometría de dichos folículos. Se utilizaron ovarios porcinos provenientes de faena. Se estudió el efecto de diferentes soportes (Criotubos, Cápsulas BEEM® y agujas de acupuntura) sobre los FPA vitrificados/atemperados utilizando 30% Etilenglicol, 20% suero fetal bovino (SFB) y 0,25M sacarosa (n=10) como agentes crioprotectores. Se evaluó el efecto de distintos porcentajes de SFB en el medio de cultivo en presencia o ausencia de hormona folículo estimulante (FSH) sobre la morfología y morfometría de los FPA del tejido fresco (n=4). Para ello las láminas fueron cultivadas durante 24 hs a 39 °C, en cámara húmeda con 5% de CO2, en placas de cultivo p12. Se utilizó un medio de cultivo base: D-MEM, ITS (1mg/ml insulina, 0,55 mg/ml transferrina, 0,5 μg/ml selenio), 2 mM glutamina, gentamicina 10 μg/ml y anfotericina B 10 μg/ml, combinado con concentraciones crecientes de SFB (0%, 5%, 10% y 20%), en ausencia o presencia (50 ng/ml) de FSH pituitaria porcina. Finalmente, para determinar el efecto del cultivo in vitro sobre las láminas vitrificadas/ atemperadas utilizando el soporte de elección determinado previamente, las mismas fueron cultivadas durante 24 hs en el medio base suplementado con 10% SFB y con distintas concentraciones de FSH (0, 50 ng/ml y 100 ng/ml) (n=10). La evaluación morfológica se realizó sobre cortes histológicos teñidos con Hematoxilina-Eosina, con microscopía de campo claro (x400). El análisis morfométrico se realizó sobre fotos digitales de los FPA obtenidas con la cámara LEICA DCC-380X® con el soporte digital del programa de captura LAS LEICA Inc®. Se determinó el área nuclear (AN), citoplasmática (AC) y total (AT) de cada ovocito utilizando el software Leica Qwin Plus® versión 3.1. La relación área nuclear/ área citoplasmática (AN/AC) también fue calculada. Para analizar diferencias entre los tratamientos se realizó el test no paramétrico de varianza por rangos de Friedman (p< 0,05). La vitrificación de tejido ovárico disminuyó el porcentaje de folículos morfológicamente normales y redujo los parámetros morfométricos evaluados en comparación con el tejido fresco. De los tres soportes evaluados, las cápsulas BEEM® produjeron la mayor reducción de folículos morfológicamente normales, mientras que no se observaron diferencias significativas en el uso de criotubos o agujas de acupuntura. A su vez, las cápsulas produjeron una reducción significativa del AN de los ovocitos de los FPA primordiales en comparación con los otros dos soportes. En los folículos primarios, los ovocitos preservaron mejor la relación AN/AC al utilizar agujas de acupuntura. El cultivo in vitro de láminas de tejido ovárico fresco en un medio con bajos porcentajes de SFB (0% y 5%) en ausencia de FSH produjo una reducción significativa en el porcentaje de FPA normales con respecto al control y los restantes tratamientos. En el caso de los FPA primordiales produjo además una reducción significativa del AN y la relación AN/AC. Con el agregado de 50 ng/ml de FSH se observó una reducción significativa del porcentaje de FPA morfológicamente normales al combinarla con 20% de SFB en comparación con el control y los demás tratamientos. El cultivo in vitro post atemperado de las láminas en un medio sin FSH redujo de manera significativa el porcentaje de FPA normales con respecto a los restantes tratamientos. También provocó una mayor reducción en los valores de AN en comparación con los medios suplementados con FSH. El uso de 100 ng/ml de FSH permitió preservar el mayor porcentaje de FPA primordiales normales en comparación con los otros dos medios. En base a los resultados obtenidos, para nuestro sistema de vitrificación de láminas de corteza ovárica porcina con etilenglicol 30% y 0,25 M sacarosa, los soportes más adecuados serían los criotubos y las agujas de acupuntura. Dada la facilidad en el manejo de las agujas de acupuntura, su uso sería recomendado. Para el cultivo in vitro post atemperado a tiempos cortos de láminas de tejido ovárico porcino se sugeriría la suplementación del medio de cultivo con 10% SFB y 100 ng/ml de FSH.
No se requiere inscripción.
No arancelado
